Механочувствительная экструзия энтеровируса А71

Природная микробиология, том 8, страницы 629–639 (2023 г.) Процитировать эту статью

2932 Доступа

14 Альтметрика

Подробности о метриках

Энтеровирус А71 вызывает тяжелое заболевание при системной инфекции, иногда приводящее к опасной для жизни неврологической дисфункции. Однако в большинстве случаев инфекция протекает бессимптомно и ограничивается желудочно-кишечным трактом, где вирус амплифицируется для передачи. Ранее было показано, что пикорнавирусы выходят из инфицированных клеток посредством лизиса клеток или секреции везикул. Здесь мы сообщаем, что целые клетки, инфицированные энтеровирусом А71, специфически экструдируются с апикальной поверхности дифференцированных органоидов толстой кишки человека, как это наблюдается с помощью конфокальной микроскопии. Дифференциальная чувствительность к химическим и пептидным ингибиторам продемонстрировала, что экструзия инфицированных вирусом клеток зависит от восприятия силы через механочувствительные ионные каналы, а не от апоптотической гибели клеток. При выделении и использовании в качестве инокулята интактные вируссодержащие экструдированные клетки могут инициировать новые инфекции. Напротив, когда чувствительность к механической силе подавляется, высвобождается большое количество свободного вируса. Таким образом, экструзия живых, инфицированных вирусом клеток из неповрежденной эпителиальной ткани, вероятно, принесет пользу как целостности тканей хозяина, так и защищенному распространению этого фекально-орального патогена внутри и между хозяевами.

Вопрос о том, как вирусы-потомки покидают инфицированную клетку или ткань, жизненно важен для нашего понимания распространения вируса внутри инфицированного хозяина и между хозяевами. На протяжении десятилетий считалось, что пикорнавирусы, как безоболочечные или «голые» вирусы, передаются исключительно литическим путем, путем резкого разрыва инфицированной клетки. Литическое высвобождение пикорнавирусов из стандартных клеточных линий тканевой культуры приводит к широкому распространению вирионов, вызывая последующие раунды инфекции. Однако для нескольких пикорнавирусов было продемонстрировано нелитическое распространение, во время которого вирусы захватывают внутриклеточные мембраны, чтобы облегчить их высвобождение из интактных клеток, скрытых во внеклеточных везикулах1,2,3,4. Одним из последствий этой стратегии передачи является то, что вместо дисперсионного распространения отдельных вирусных частиц вирусы передаются целиком внутри мембранных пакетов5.

Модели эпителиальных органоидов являются интересным инструментом для изучения тканеспецифических реакций на патогенные воздействия6,7. Трехмерные сферические органоиды, полученные из стволовых клеток взрослых, можно дифференцировать, чтобы воссоздать разнообразие типов клеток, присутствующих в нативных тканях8. Органоиды обычно растут апикальными поверхностями, обращенными к внутренним просветным отсекам. 2D-поляризованные монослои или органоиды, которые были механически разрезаны для обеспечения апикального доступа энтеровируса A71 (EV-A71), использовались для моделирования инфекции EV-A71 желудочно-кишечного эпителия9,10,11. Недавно были разработаны методы инвертирования органоидной топологии, позволяющие представить апикальную поверхность желудочно-кишечного эпителия непосредственно кишечным патогенам, сохраняя при этом целостность эпителия12,13. В этой статье эти апикальные органоиды используются для мониторинга заражения эпителиальных клеток EV-A71 и последующих механизмов распространения вируса в этой ткани.

Мы были заинтересованы в использовании апикальных эпителиальных органоидов желудочно-кишечного тракта в качестве модели инфекции EV-A71, при которой сохраняется целостность эпителиального барьера. Мы решили использовать органоиды, полученные из ткани толстой кишки (колоноиды), из-за близости толстой кишки к выходу вируса из инфицированного хозяина, чтобы лучше понять передачу EV-A71. Колоноиды, полученные из ткани крипт взрослого человека, выращивали на каркасах базальной мембраны в присутствии стволовых факторов, включая WNT и R-спондин, образуя сфероиды стволовых клеток с их базолатеральной поверхностью, обращенной наружу, и их люменальной, апикальной поверхностью, обращенной внутрь. За пять дней до заражения колоноиды удаляли из каркаса базальной мембраны и хранили в суспензионной культуре в отсутствие матрикса, чтобы вызвать изменение топологии органоида так, чтобы апикальные поверхности располагались снаружи органоида (апикально наружу)12. В то же время применяли среду для индукции дифференцировки клеток. В этих апикальных колоноидах человека мы наблюдали за организацией актинового цитоскелета и рецептора EV-A71 SCARB2 (рис. 1а). Апикальная поверхность хорошо дифференцированных и поляризованных колоноидов содержит микроворсинки щеточной каймы, которые легко идентифицировать при окрашивании F-актином как толстый, богатый актином слой. SCARB2 является интегральным лизосомальным мембранным белком, который циклически перемещается к апикальной поверхности поляризованных монослоев 14,15 и обильно экспрессируется в этих апикально-внешних колоноидах (Рис. 1a).